20181018 RAD-Seq Library備置測試

接續20181017 RAD-Seq Library備置測試使用NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®的protocol。

1.1 NEBNext End Prep

使用10/17這管,20ul(濃度31.6ng/ul)開始此步驟。這管全部接續下面步驟。(此kit建議起始DNA量:500pg~1ug,故為符合。)補水30ul,達kit要求體積50ul。

1.2 Adaptor Ligation

10/17使用新的P2 Adapter 1ul。

1.3 Size Selection or Cleanup of Adaptor-ligated DNA

上一步最後總體積為93.5ul,接續此步驟。

1.4 PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA

1.5 Size Selection or Cleanup of Amplification

膠圖很糟,需要再重跑10/18 Final(擴增並且最後一步Size Selection結束。)RAD template已用完。從濃度來看,應有擴增,但效率不佳。

USER 2018-10-18 16hr 13min.jpg

___________________________________

接續

1. 重新跑10/18 Final的膠,確定片段大小。(*20181023更新:已重新跑膠。)

2. 從樣本合併剩餘樣本(約剩17ul)開始。

 

USER 2018-10-23 09hr 47min

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20181017 RAD-Seq Library備置測試

此次目標為:確定擴增問題是否為P2 Adapter的量。此篇主要解決要點:

  1. P2 Adapter減量:1ul。

_______________________________

1.2 限制酶切割

1.3 P1 Adapter連結酶反應

1.4 樣本合併

1.5 混合樣品DNA分子的隨機斷裂

使用9/20用剩之6管(20180918-28 RAD-Seq Library備置測試),10/17以下步驟剩餘後六管開始

1.6 DNA的濃縮與片段篩選

10/17 此步驟的DNA濃縮,使用Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) 兩管回收(三震碎管入一管濃縮),Wash buffer步驟僅使用一次(Kit protocol中為兩次),使用水回溶,最後合併約70ul的溶液。(回溶分兩次:第一次20ul,第二次15ul。)

10/17 階段目標的膠圖和濃度:片段為200~500bp之間,濃度為31.6ng/ul,回溶23ul(-2ul於跑膠和測濃度)。>500bp濃度為28.2ng/ul。USER 2018-10-17 14hr 57min.jpg

後續使用NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®的protocol。

 

20181004-12 RAD-Seq Library備置測試

接續20181004 Pst1 活性測試。此次目標為:解決擴增問題。此篇主要解決要點:

  1. 破碎DNA: 300 – 400 bp。
  2. P2 Adapter減量:1ul。
  3. 比較單純擴增後的濃度和膠圖。

 

10/4 使用Sample:20181004 Pst1 活性測試

1.2 限制酶切割

使用新購Pst1。20181004 Pst1 活性測試

1.3 P1 Adapter連結酶反應

20181004 Pst1 活性測試

1.4 樣本合併

由於只有三個樣本,每個樣本使用17ul置於一管(總體積約為50ul),進行下一步震碎。

1.5 混合樣品DNA分子的隨機斷裂

震碎為一管為須震碎樣本(50ul),其於11管裝水,使用Biouptor Pico,由於上次經驗,一次10+10循環使片段過小(200~500bp),此次目標為300~400bp。

這個slideshow需要JavaScript。

1.6 DNA的濃縮與片段篩選

此步驟的DNA濃縮,使用Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) 一管回收,Wash buffer步驟僅使用一次,使用水回溶,最後約70ul的溶液。

10/11 (原10/4)片段篩選:此次片段篩選較為準確,從膠圖中能看出兩次片段篩選有差異,但300-500bp片段較少。但由於這次測試下的量較少(以往12管濃縮成一管,這次就三個樣本1管),故無法達成階段濃度50ng/ul。

USER 2018-10-11 17hr 14min

1.1 NEBNext End Prep

10/11 約剩20ul(濃度2.88ng/ul),這管全部接續下面步驟。(此kit建議起始DNA量:500pg~1ug,故為符合。)補水30ul,達kit要求體積50ul。

9/20 這管10ul(濃度94.4ng/ul),開始此步驟。(為上次剩餘20180918-28 RAD-Seq Library備置測試)補水40ul,達kit要求體積50ul。

1.2 Adaptor Ligation

P2 Adapter減量:「宜軒使用量:P2 Adapter 10uM(自製)使用量:1ul。」

10/11 使用新的P2 Adapter 1ul。

9/20 使用舊的P2 Adapter 1ul。(2016年分裝,為當時從台大帶過來的。)

1.3 Size Selection or Cleanup of Adaptor-ligated DNA

上一步最後總體積為93.5ul,留下3.5ul,進行跑膠測試。以90ul接續此步驟。

#此處低級錯誤,由於最後的9/2010/11template管子忘記標示,無法區分,以左右表示。>500管子都有區分。(請務必注意,管子標誌問題!!!)

USER 2018-10-12 14hr 46min.jpg

1.4 PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA

使用陳老師protocol的AMPure的片段篩選。從膠圖來看,結果是稍有擴增的(又以10/11 >500的為明顯,但不明白為什麼9/20的擴增前反而比擴增後的亮。)。由於此次在最後一次的磁珠片段篩選前有跑膠,故還可看見下方有dimer殘留。

USER 2018-10-12 16hr 00minUSER 2018-10-12 16hr 02min

1.5 Size Selection or Cleanup of Amplification

尚未操作。

 

___________________________________

上次潛在問題 和 此次改善:

1.限制酶 Pst1-HF為台大所帶過來,為去年(2017)購買,是否失效?

A: 此次測試10/11為新購Pst1-HF。

2.是否P2 Adapter放太多了?

A: P2 Adapter減量,使用量:1ul。

3.Solexa primer為台大所帶過來,為去年(2017)購買,是否失效?

A: 不確定效率,但以此次測試經驗,應有擴增成功。

4.擴增失敗原因,不知道是最後一步片段篩選的問題,或是真的擴增失敗?(擴增失敗原因可能為?)

A: 此次在最後一次片段篩選前,有和template做比較跑膠。可以發現有些為擴增跡象,以及dimer。

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20181004 Pst1 活性測試

接續上篇實驗紀錄20180918-28 RAD-Seq Library備置測試,開始嘗試解決為成功擴增問題。由於研究室的Pst1限制酶已過期,且並未分裝。故先以接P1前的Pst1的限制酶活性為此篇主要解決要點:購買新的Pst1,並以其和過期的Pst1,測試新舊效果。

10/4 使用Sample如下:

P1 Adapter
ng/uL
需要1ug所需的量 (uL)(1ug=1000ng)
實驗用量(四捨五入)
補水(總體積44uL)
1
CF023
KFC  3604-4
93
10.75268817
11
33
2
CF025
KFC  3604-6
99.8
10.02004008
11
33
3
CF026
KFC  3605-3
92.4
10.82251082
11
33

結果

USER 2018-10-04 13hr 45min (1).jpg

發現:切割過後的DNA大小並未有明顯差異,並無法以膠圖確認限制酶活性。若以新的限制酶能有效切割為前提,此結果有可能為:1. Pst1切割後,DNA片段依然為大? 2. 舊的限制酶依然可以使用?

接續:使用此3個 10/4 sample繼續接下來的實驗步驟,藉著上次經驗:

1. 在破碎DNA時請注意:「直到大多數的 DNA 分子大小斷裂成為 300 bp 到 400 bp 之間。」不可太小,一上次經驗,直接10+10循環會使片段過小(200-300 bp)。可先測試:10、10+5。一管裝盛50uL。

2. P2 Adapter減量:「宜軒使用量:P2 Adapter 10uM(自製)使用量:1ul。」

3. 測試單純擴增後的濃度和膠圖。

___________________________________

20180918-28 RAD-Seq Library備置測試中的9/20這管(剩餘約10ul)繼續:

1. P2 Adapter減量:「宜軒使用量:P2 Adapter 10uM(自製)使用量:1ul。」

2. 測試單純擴增後的濃度和膠圖。

 

 

20180918-28 RAD-Seq Library備置測試

此次備置測試的樣本取得和標準:(寄給黃雅怡 博士的信件內容)

Test Run會以HiSeq 2500 pairend 100 bp定序,使用限制酶為PstI。這個lane中會有約40~50個個體間,所以會需要你們的個體數約有十個。(另外我們還有其他預計樣本:構樹*30、龍膽屬*10)由於實驗要一起執行,但因其他樣本都尚未備齊,預期在八月中下旬開始製備。所需樣本DNA條件如下:

1. 1μg genomic DNA,濃度 >25 ng/μL
也就是1μg DNA要溶於小於44 μL的水,不符合的話,請濃縮,或DNA量要足夠。DNA量"至少 “1 μg,如果可以多一點會更好。

2. 回溶DNA的液體請用水,不要TE buffer
特別注意絕對不要有鹽份和酒精的殘留,在抽取DNA時酒精要充分揮發。

3. DNA品質,不可有二次代謝物或色素
我是使用Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg)。
請記得所第1.點要求的DNA濃度是在純化後的濃度,簡單說DNA的質和量都要達標準。

4. DNA片段大小完整,不要smear

此次測試注意:

1. 不要來源難以取得或DNA量稀少的樣本
我過去是在台大別人的研究室做這個實驗,故目前尚未在中研院研究室獨立做過RAD-Seq Library製備,所以此次test run主要目的是以測試、建立經驗為主。等此次後成功之後,再來嘗試那些樣本比較保險。(簡單說,若不小心失敗,我會自責毀了你們的心血)

2. 預計在8/13那禮拜給我樣本
如果可以,先寄給我看一下DNA的相關品質資料:260/280 ratio、260/230 ratio(nanodrop)、ng/μL(Qubit)和膠圖。

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9/17 使用Sample如下:

P1 Adapter
ng/uL
需要1ug所需的量 (uL)(1ug=1000ng)
實驗用量(四捨五入)
補水(總體積44uL)
1
CF023
KFC  3604-4
93
10.75268817
11
33
2
CF025
KFC  3604-6
99.8
10.02004008
11
33
3
CF026
KFC  3605-3
92.4
10.82251082
11
33
4
CF027
KFC  3605-4
106
9.433962264
10
34
5
CF008
KFC  3606-1
45.2
22.12389381
23
21
6
CF028
KFC  3606-3
110
9.090909091
10
34
7
CF029
KFC  3608-3
102
9.803921569
10
34
8
CF030
KFC  3608-4
64.6
15.47987616
16
28
9
CF012
KFC  3609
28.4
35.21126761
36
8
10
CF013
KFC  3610
36.8
27.17391304
28
16
11
CF034
KFC  3611
70.6
14.16430595
15
29
12
CF037
KFC  3613-5
98.8
10.12145749
11
33
13
CF038
KFC  3614-1
66.4
15.06024096
16
28
14
CF016
KFC  3615
33.4
29.94011976
30
14
15
CF018
KFC  3616-2
45
22.22222222
23
21
16
CF042
KFC  3617-2
31.4
31.84713376
32
12
17
CF043
KFC  3618-1
29
34.48275862
35
9
18
CF045
KFC  3618-3
76
13.15789474
14
30
19
CF046
KFC  3619-1
104
9.615384615
10
34
20
CF047
KFC  3619-2
52.6
19.01140684
20
24
21
CF051
KFC  3619-6
90.6
11.03752759
12
32
22
CF058
KFC  3619-G
94.2
10.61571125
11
33
23
CF060
KFC  3620-2
69.4
14.4092219
15
29
24
CF061
KFC  3620-3
54.4
18.38235294
19
25
25
CF062
KFC  3621
27.8
35.97122302
36
8
26
CF067
KFC  3625
31.2
32.05128205
33
11
27
CF068
KFC  3628
47.4
21.09704641
22
22
28
CF069
KFC  3629
38.2
26.17801047
27
17
29
C252
KFC3601_6
156
6.41025641
7
37
30
CF073
KFC  3643-4
108
9.259259259
10
34
31
FG26
37
27.02702703
28
16
32
GB1
63.8
15.67398119
16
28
33
GB2
39.8
25.12562814
26
18
34
LM15
39.4
25.38071066
26
18
35
LM19
51.6
19.37984496
20
24
36
LM3
71.4
14.00560224
15
29
37
MD7
38.2
26.17801047
27
17
38
SUGM19
63.2
15.82278481
16
28
39
WA2-5
39.6
25.25252525
26
18
40
WK7
36.2
27.62430939
28
16
41
4
28.7
34.84320557
35
9
42
12
31.4
31.84713376
32
12
43
20
34
29.41176471
30
14
44
23
27.1
36.900369
37
7
45
24
27
37.03703704
38
6
46
25
29.28
34.15300546
35
9
47
27
32.9
30.39513678
31
13
48
32
25.2
39.68253968
40
4
49
33-2
28.4
35.21126761
36
8
50
24-1
25.4
39.37007874
40
4

P1 Adapter 1~30為構樹(DNA來自嘉瑢)、31~40為珊瑚(DNA來自黃雅怡博士)、41~50為龍膽(DNA來自景淞)。濃度為DNA抽取者所提供。在實際操作時發現:在做的時候發現黃博士給我的十個sample,有七個sample的DNA量都不足1ug。如FG26濃度為37 ng/ul,那至少要有28 ul,才有1ug (37*28=1036 ng),不過他們的sample的體積都只有約15 ul。由於事先沒有再次檢查,但因為已經做下去又臨時無法改變,所以我只用了其中的三管(GB1、LM3、SUGM19)。

___________________________________

實驗protocol outline:這是由我改寫的protocol,此步驟在我的碩士論文研究中有使用過(當時擴增的效率並沒有使用陳老師protocol的好,故最後定序是使用後者protocol的樣本)。李宜軒亦使用此套protocol,在李宜軒的論文中有詳細記載。

主要使用陳凱儀 老師lab的protocol

1.2 限制酶切割

1.3 P1 Adapter連結酶反應

1.4 樣本合併

1.5 混合樣品DNA分子的隨機斷裂

1.6 DNA的濃縮與片段篩選

後續使用NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®的protocol

1.1 NEBNext End Prep

1.2 Adaptor Ligation

1.3 Size Selection or Cleanup of Adaptor-ligated DNA

1.4 PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA

1.5 Size Selection or Cleanup of Amplification

___________________________________

1.2 限制酶切割(9/18 17:00 – 9/19 8:00)

潛在問題:限制酶 Pst-HF(2016/11過期)為台大所帶過來,是否已失效?

1.3 P1 Adapter連結酶反應(9/19)

1.4 樣本合併(9/19、9/20)

此步驟有個主要變因為DNA破碎機器改變:為使用Biouptor Pico。劉世慧 博士的經驗為:1. 大於3K的DNA經過三個循環(一循環為一次啟動/停止,皆為30秒),即可達300~700 bp。2. 裝取100ul的效率比裝載50ul的破碎效率好。故當時將陳老師的Protocol(每一個離心管裝50ul,至少總共21個循環)調整成:每一個離心管裝100ul,初次以2個循環,跑膠檢視片段大小,在逐一增加循環次數。

9/19:調整:每一管裝載100ul,故每個接完P1的樣本需各取28ul,最後合併為1200ul樣本,再分裝至12管0.65ml的microtube中。(注意!調整成100ul,預期外的問題*出在後續 1.6 DNA的濃縮與片段篩選。)

9/20:未調整:每一管裝載50ul,故每個接完P1的樣本需各取15ul,最後合併為600ul樣本,再分裝至12管0.65ml的microtube中。連結完成P1 Adapter的每個樣品體積為60ul,經9/199/20 兩次使用,目前剩餘60-28-15=17ul可從此步後續從新開始)。

1.5 混合樣品DNA分子的隨機斷裂

9/19:每一管裝載100ul,累加循環2、2+4、2+4+10、2+4+10+10循環。此測試發現:並沒有發生劉博經驗中的高破碎效率(差異可能為DNA的溶液差別?)。最後試出來的結果,和陳老師Protocol的次數相去不大。故我將此步驟維持為20個循環。

這個slideshow需要JavaScript。

9/20:每一管裝載50ul,直接10+10循環。此測試發現:大部分的片段為200~500bp左右。(9/20接下來僅用前面6管,剩餘六管可從此步驟開始。)(*20181017更新:此六管剩餘已於20181017 RAD-Seq Library備置測試使用完畢。)

USER 2018-09-20 15hr 54min.jpg

1.6 DNA的濃縮與片段篩選

9/199/20 濃縮:此步驟的DNA濃縮,使用Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) 四管回收,Wash buffer步驟僅使用一次(Kit protocol中為兩次),使用水回溶,最後合併約70ul的溶液。

9/19 片段篩選:在DNA破碎的步驟,每一管裝載100ul,故DNA量其實為陳老師protocol量的兩倍,此時發現的預期外問題*為,DNA量增加兩倍,導致AMPure磁珠在操作上有很大的問題:幾乎無法受到磁鐵的吸引,磁珠和溶液無法分離。(9/19這管的實驗至此步停止)

9/20 片段篩選:在DNA破碎的步驟,每一管裝載50ul,在AMPure操作上順利。(接下來步驟由9/20這管繼續)階段目標的膠圖和濃度:片段為200~500bp之間,濃度為94.4ng/ul,回溶23ul(-2ul於跑膠和測濃度)。取DNA 1ug(此次使用為10ul,還剩餘約10ul,還可從此步後續從新開始)(*20181012更新:此管剩餘已於20181004-12 RAD-Seq Library備置測試使用完畢。)繼續下一步驟。

USER 2018-09-25 12hr 30min copy

後續使用NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®的protocol

1.1 NEBNext End Prep

使用9/20這管,10ul(濃度94.4ng/ul)開始此步驟。

1.2 Adaptor Ligation

我這次測試P2 Adapter 10uM(自製)使用量:2.5ul。(宜軒:10uM, 1ul、Kit官方Adapter:15uM, 2.5ul)潛在問題:是否P2 Adapter放太多了?

1.3 Size Selection or Cleanup of Adaptor-ligated DNA

片段篩選後的RAD library template濃度為:5.72ng/ul(protocol階段目標至少為:4ng/ul,最後體積為15ul,DNA量才能達50ng。)

1.4 PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA

自製Solexa primer 10uM各放5ul,並使用Kit protocol中的PCR擴增程式。潛在問題:Solexa primer為台大所帶過來,為去年(2017)購買,是否失效?

1.5 Size Selection or Cleanup of Amplification

使用陳老師protocol的AMPure的片段篩選。結果並未擴增成功。潛在問題:沒有測試到單純擴增後的濃度和膠圖,不知是否為最後一步片段篩選的問題,或是真的擴增失敗。

USER 2018-09-27 16hr 51min.jpg

___________________________________

潛在問題 總整理:

  1. 限制酶 Pst-HF為台大所帶過來,為去年(2017)購買,是否失效?
  2. 是否P2 Adapter放太多了?
  3. Solexa primer為台大所帶過來,為去年(2017)購買,是否失效?
  4. 擴增失敗原因,不知道是最後一步片段篩選的問題,或是真的擴增失敗?(擴增失敗原因可能為?)

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20181002 妤馨 建議:

我看了你的實驗紀錄。對於enzyme的活性有些懷疑。因為你是做complete digestion,可是在電泳圖看來,還有很多intact DNA。這代表這能有很多DNA沒有被切斷。不過這也有可能是酵素的特性。
不知道你之前使用這個酵素的經驗,是否也有很多intact DNA存留的情況
我以前測試酵素時,會拿一些DNA切切看,然後將具有相同濃度有切跟沒有切的DNA一起跑電泳,然後就會知道酵素有沒有切動以及切的效率為何
不知道你或宜軒以前成功的library是否有留下?假如你想知道Solexa primer是否失效,可以把以前已知濃度的library當作template,然後PCR看有沒有amplify成功

還有,實驗室的磁珠已經過期,雖然學姊有測試過沒有問題,還是得小心使用。
在1.6電泳圖裡,長度好像跟你標示的都不一樣,大部份的片段都集中在150bp? 有點不確定這個marker長度
在10+10的電泳圖裡,ladder最下面那一團不是100bp吧?假如我沒搞錯,這樣蠻多管的長度都只有100-200bp耶…

我 回覆:

1. 酵素反應後的片段大小。這點我覺得是我忽略的部分。我們之前不會特別測試酵素的活性(像是看膠圖這類的),這點我覺得很重要,非常感謝提醒。畢竟酵素也是前年買的,又從台大帶過來,我想可能會有問題。
2. 這次震碎的片段大小都偏小。這是問題。圖上面標示的,是那次膠圖的目標大小,非實際大小。所以這次在DNA破碎上沒有掌控好。因為第一次分次2+4+10+10的流程,最後好像還是有很大片段,所以第二次我就直接連續的10+10,但就震太小了。這我有想過,這之後會在注意。只是覺得這應該不是影響沒有擴增的主因。不過很謝謝提醒。

現在我打算:買新的酵素。感覺舊的酵素(還沒有分裝)比新訂的primert出問題的機率高太多。

想入門RAD-Seq卻不知從何開始讀的文獻推薦

這篇寫給剛要入門NGS和相關實驗、或是要做RAD-Seq (或Target-enrichment) ,卻不知道要從何找起資料的你:

先釐清幾個名詞概念:

次世代定序Next Generation Sequencing (NGS) :主要以massively parallel sequencing的概念建構的高通量技術,達到同時高速大量的核酸定序。簡單說,他就只是一種定序的概念,不同公司就發展出不同的定序策略,以達到大量、平行定序的目標,常見的公司像是illumina系列。(這部分的介紹、優缺點、和Sanger定序比較很多,網路隨便google都有,中文資料也很多。)

圖書庫 建庫 Library Construction:要餵給NGS定序機器之前的實驗步驟(可以自己做或給別人做)依造你的材料或目標,又可以分成許多不同策略:像是RAD-Seq或Target-enrichment,底下也還有細分成不同方法,如[RAD seq之外] HyRAD & HyRADX就屬於在這個階層的範疇。

好,再來就幾篇文章可以先看:

RAD-Seq的原始使用,並非用在解決Phylogeny的領域,所以這幾篇介紹文獻,如2008年Baird等人寫的第一篇、第一次發表的RAD-Seq的文章,並沒有很好理解,畢竟他主要不是在做Phylogeny,但就經典就看看吧,算是對於RAD-Seq透測了解的知識:

Baird, Nathan A., et al. “Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers." PloS one 3.10 (2008): e3376.

Davey, John W., and Mark L. Blaxter. “RADSeq: next-generation population genetics." Briefings in functional genomics 9.5-6 (2010): 416-423.

接下來推薦一系列的文章,或是他其實是一本書。這本裡裡面有8個章節,八個大主題,很淺顯易懂,加上主題就是環繞在我們領域相關(Plant Systematics)以及NGS,讀起來也會比較輕鬆。雖然有點太淺顯,僅適合當入門閱讀,若要深入瞭解一些細節,就需要再自己找資料。裡頭的第六章就是介紹RAD-Seq。但可能要找找看,似乎太不好拿到電子檔。

Regnum Vegetabile Volume 158 Next-Generation Sequencing in Plant Systematics

這篇Nature的Review寫得很不錯,主要介紹了幾種RAD-Seq的不同變形。(我都戲稱他們為RAD-Seq家族),可以在弄懂了RAD-Seq的方法之後,擴展橫向知識的文章:

Andrews, K. R., Good, J. M., Miller, M. R., Luikart, G., & Hohenlohe, P. A. (2016). Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics. Nature Reviews Genetics17(2), 81.

關於使用RAD-Seq解決 維多利亞湖 慈鯛輻射演化的例子,這就是關於Phylogeny了,加上這類群又是非模式物種,和我的例子比較接近:(現在這類的應用已經非常廣泛,隨便找都有,只是就我讀的第一篇,內容也不會太艱澀)

Wagner, Catherine E., et al. “Genome‐wide RAD sequence data provide unprecedented resolution of species boundaries and relationships in the Lake Victoria cichlid adaptive radiation." Molecular ecology 22.3 (2013): 787-798.

再來就是在實驗操作RAD-Seq上(可以只看材料與方法部分即可),我是先看我的共同指導老師的文獻(中英文各一篇):

謝明修, 吳東鴻, and 陳凱儀. “使用限制酶位點標定之核酸定序法進行稉稻雜交組合之穗上發芽數量性狀基因座的遺傳定位." 作物, 環境與生物資訊, 11 (1): (2013): 11-25.

Chen, Ai-Lin, et al. “Reassessment of QTLs for late blight resistance in the tomato accession L3708 using a restriction site associated DNA (RAD) linkage map and highly aggressive isolates of Phytophthora infestans." PloS one 9.5 (2014): e96417.

 

以上幾篇就是先推薦給剛入門卻不知道要從何找起資料的你,可以先看看。這幾篇都看完之後,就會慢慢有方向,再來就可以去看看新一點的文章。RAD-Seq相關的文章,幾乎每個月都有新的文章,每次稍微找一下,都有最新的文章出爐(關於分析軟體、新的實驗流程、門檻值設定和缺值的探討、用在不同族群的應用等),最後就會讀出心得,尤其一開始對於一些專有名詞的混亂,這可能要稍微適應一下,在NGS這個領域到現在,無論是RAD-Seq或Target-enrichment,很多相同意思不同字,或是不同意思或同一字的情況很多,端看那篇文章採用哪一種,但也可以自己做一些筆記,幫助自己釐清。對了,上面有提到的Nature的Review(2016)中,旁邊的box裡有專有名詞解釋。

接下來我應該會再寫一篇關於RAD-Seq的Raw data整理和分析相關的文獻整理,先醬。