【Experimental Log】2015/3/28-29

8 Sample:97 (B. brevisepala), 157 (B. morrisonicola), 192 (B. nantoensis), 274 (B. sp.), 569 (B. aristatoserrulata), 601 (B. mingtsuensis), 623 (B. hayatana), 630 (B. hayatana) [為Brenden的Sample們,需要試試看怎樣的情況是能用的。]

DNA extraction:CTab (測量葉片用量為全為0.05 g (樣本葉子皆有拍照記錄目前情況,有好有壞)。在65度時放入搖晃機中,約莫一小時,包括海砂。總體積用50 (-1) ug去溶。皆有過Colum)

NanoDrop (曲老師實驗室):97 (B. brevisepala):21.2 ug/mL, 1.1 260/280, 0.3 260/230, 157 (B. morrisonicola):183 ug/mL, 1.36 260/280, 0.56 260/230, 192 (B. nantoensis):16.5 ug/mL, 1.03 260/280, 2.19 260/230, 274 (B. sp.): ug/mL,  260/280,  260/230, 569 (B. aristatoserrulata):25.8 ug/mL, 1.64 260/280, 0.7 260/230, 601 (B. mingtsuensis):33.5 ug/mL, 1.18 260/280, 0.34 260/230, 623 (B. hayatana):50.4 ug/mL, 1 260/280, 0.27 260/230, 630 (B. hayatana):48.9 ug/mL, 1.77 260/280, 0.97 260/230。[曲線也不夠好。]

Note:這次主要是要測試學長所給我的sample的狀況,選擇了八個sample,分別有2008年(97) 到2011年 (630),但不同種也會影響保存情況 (還沒全部挑完標本,希望近期內挑完。) 使用CTab抽DNA,已知用此方法濃度雖高,但雜質亦多。但在舊樣品中的抽取,發現出來的濃度不夠,雜質也非常多。可能最後需要多過幾次colum (EasyLid的加PX3步驟。) 或是,不知道有沒有比較好的方法。(希望能和老師或學長姐討論)

20150330 早上和陳凱儀家學姊和宜軒一起去石牌站陽明大學基因體中心送之前做的library。以後就要自己去送了。還是希望能快點解決sample收集的問題。老趙和阿班終究也分手了。

20150402-06 雪山 (with中興研究室),希望順利。

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【Experimental Log】2015/3/23

2 Sample:CP61 (B. kawakamii), CP84 (B. aristatoserrulata)

注意!送的成品濃度至少要10 μg/mL (送陽明),體積要10mL。所以我們會準備至少15mL。但因此次的濃度太低,所以我們準備17 mL,2mL個去測Qbit和跑膠。使用AMPure (磁石) 洗的時候,在pipeting時不可以有泡泡,且要使用有filter的tip。

已符合送定序狀態。

Note:其中有很多零碎的小時間,需要找一些事情做比較好。要開始整理Brenden的sample,哪裡可用哪裡不可用。

【Experimental Log】2015/3/16-17

2 Sample:CP61 (B. kawakamii), CP84 (B. aristatoserrulata)

RAD-seq technology library:從第二步驟到DNA的濃縮與片段篩選。後面還有DNA 破裂端修補反應和P2 adapter連結反應,預期3/23繼續。

Qubit:CP61 (B. kawakamii):84.1 μg/μL (原NanoDrop:178.4 μg/μL);CP84 (B. aristatoserrulata):85.0 μg/μL (原NanoDrop:70.8 μg/μL) [品質和濃度皆足夠做三重複,但濃度間的差異依然無解。] → 通過限制酶切割要求。(2015/3/16,過夜)

Barcode P1 Adapter + Sample:CP61 (B. kawakamii) – P1-22 (CCCCA);CP84 (B. aristatoserrulata) – P1-23 (CCGGT)

DNA random shearing:21分鐘為基本震碎時間(3次循環),取1ul DNA進行電泳,確認震碎情況。若未達目標大小,則每7分鐘確認一次片段大小。 [3次循環震盪後跑膠,發現片段已大概集中在300-500 bp即可。] → 通過震盪片段大小要求。

DNA的濃縮與片段篩選:濃縮:使用MinElute管柱要記得要靜置。片段篩選:要看膠圖再決定是否要兩邊都要0.6和0.8倍的磁石都要加?(是否有大於500bp?或有小於200bp?在看,否則會篩掉太多原本要的。) [300-500 bp:52.2 μg/μL;500 bp ↑:72.4 μg/μL。顯然500 bp ↑洗掉的濃度太高了,是否需要震碎?]

Note:一切都還算順利。謝謝。不知道要謝誰,就謝天吧。

【Experimental Log】2015/3/11-12

2 Sample:CP59 (B. nantoensis), CP84 (B. aristatoserrulata)

DNA extraction:CTab (測量葉片用量為CP59:0.1 g;CP84:0.05 g (因為一開始覺得CP59比較舊,CP84比較新鮮)。在65度時放入搖晃機中,約莫一小時,包括海砂。總體積用50 (-2) ug去溶。皆有過Colum)

NanoDrop (曲老師實驗室):CP59 (B. nantoensis):141.3 ug/mL, 1.94 260/280,3.16 260/230, CP84 (B. aristatoserrulata):70.8 ug/mL, 1.90 260/280, 2.26 260/230 (CP84“沒有意外"可以用!!! CP59隨然濃度夠,但還是稍嫌髒,波的後面有起伏)

Note:第二次使用CTab抽DNA,已知用此方法濃度雖高,但雜質亦多。故在最後再過一次colum (EasyLid的加PX3步驟。) 看到CP59和CP84的兩樣品濃度,屏除雜質不說外,可以看到濃度搭約差兩倍,而恰好和一開始所放的葉片重量他兩倍。故大概能估出多少一片量可以抽出多少DNA濃度了。這是件好事。

【Experimental Log】2015/3/9-10

2 Sample:CP54 (B. nantoensis), CP61 (B. kawakamii)

DNA extraction:CTab (測量葉片用量為0.1 g。在65度時放入搖晃機中,約莫一小時,包括海砂。總體積用50 (-2) ug去溶。)

NanoDrop (曲老師實驗室):CP54 (B. nantoensis):100.4 ug/mL, 1.43 260/280, 0.56 260/230, CP61 (B. kawakamii):331.2 ug/mL, 1.62 260/280, 1.10 260/230 ,(以下是再過一次colum做的)  CP54 (B. nantoensis):0.1 ug/mL, -0.41 260/280, -0.03 260/230, CP61 (B. kawakamii):178.4 ug/mL, 1.92 260/280, 2.24 260/230。(過一次colum的CP61可以用!!!)

Note:第一次使用CTab抽DNA,已知用此方法濃度雖高,但雜質亦多。故在最後再過一次colum (EasyLid的加PX3步驟。) 發現CP61的濃度足夠外,其波形也不錯。但CP54卻幾乎洗光。CP54的原葉子樣本就比較偏咖啡色,且很多小片小片的。但CP61比較綠,且是兩大片。我想這會影響之後的結果。然而,群智學姐也再訂了新的kit (和之前的不同),希望也能試試看。否則氯仿有毒,且花費時間也比較多。CTab沒想像中的那麼麻煩,希望不要被kit寵壞了。

或許,我應該說些什麼。我想我只能說對不起。
很多人問我,來台大有什麼想法,我只說:從零開始。確實。還不到一年前,什麼實驗、什麼分子親緣DNA觀念,我想都沒有想過,如今在這裡,那是我已經在面對的挑戰。來到台大,人生地不熟,自已所熟悉的一切、過去最好的朋友,都在他處。走著走著,也到了現在。身旁的每天見面的,也是唯一的,生活只有你們而已。
來到這裡,我能發誓,我從未抱怨過好或壞,從未抱怨過困難或容易。下這個決定的同時,我比誰都清楚所面臨的這一切,是必經的。那些或許你們覺得簡單或理所當然的,我花費一些努力趕上,努力補齊。或許,我也曾想過,是不是做了個糟糕的決定?也曾想過放棄,因為我知道,在這兩三年或三四年內,我就要從零到畢業?光想就很不踏實,說什麼做研究,不就是洗學歷罷了?我面對很多質疑,也揹著很多家裡的期待,我好像沒有什麼資格回頭或抱怨。我告訴自己,要好好學習,對於所有新的事物保持好奇。可是,我好像還是比想像中慢了一些。
實驗結果頻頻不如預期,生活瑣事頻頻出狀況,突如其來的海報無法如期產出,家裡也遭受我的情緒波及。今天下午,你們的爭執,像是我情緒的最後一根稻草,不敢流淚,只是僵笑著,直到家才潰堤,怎麼也哭不停。我很責怪自己,我很愧疚。突然毫無頭緒,不知要從何處開始努力。
明天早上還是要做實驗,還要和老師抱歉大綱依然難產。我還是會把它寫出來,因為那是我一直慢慢在做的。我真的想謝謝你,花了一些心力在我身上,也因為我而困擾。我還想說,來到這裡,能認識你們,是我不曾後悔的原因。

【Experimental Log】2015/3/6

2 Sample:CP70 (B. kawakamii), CP83 (B. aristatoserrulata) [重複一次 by 宜軒] (CP70 不能用,加錯。)

DNA extraction:EasyLid (測量葉片用量為0.05 g。在65度時放入搖晃機中,約莫一小時,包括海砂。WS洗了三次。總體積為50 ug。)

NanoDrop (曲老師實驗室):CP70 (B. kawakamii):42.7 ug/mL, 1.62 260/280, 1.02 260/230, CP83 (B. aristatoserrulata):28 ug/mL, 1.9 260/280, 1.92 260/230 ,(以下宜軒做的)  CP70 (B. kawakamii):66.3 ug/mL, 1.67 260/280, 1.09 260/230, CP83 (B. aristatoserrulata):49.9 ug/mL, 1.8 260/280, 1.42 260/230。

Note:對照組,確認是人還是小檗的問題。兩個人做同樣sample,感覺結果沒有差太多。

【Experimental Log】2015/3/4

5 Sample:CP53 (B. kawakamii), CP61 (B. kawakamii), CP71 (B. nantoensis), CP84 (B. aristatoserrulata)

DNA extraction: EasyLid (測量葉片用量為0.05g。用鋼珠磨,感覺有點太粗了。在65度時放入搖晃機中,約莫一小時,包括鋼珠。PX1和PX2加protocal的1.5倍。WS洗了三次。總體積為100 ug。)

NanoDrop (曲老師實驗室):CP53 (B. kawakamii):94.4 ug/mL, 1.37 260/280, 0.73 260/230, CP61 (B. kawakamii):27.1 ug/mL, 2.16 260/280, 3.54 260/230 , CP71 (B. nantoensis):27.2 ug/mL, 1.40 260/280, 0.9 260/230 , CP84 (B. aristatoserrulata):12.3 ug/mL, 2.03 260/280, -3.48 260/230 (依然不夠,雜質太多)

Note:皮包莫名找不到,實驗結果又不OK,有點累了。要繼續加油。ˊ   ˋ