【Experimental Log】2015/3/2

5 Sample: CP92 (r1, B. ravenii), CP91 (a5, B. aristatoserrulata, not sure), CP48 (B. nantoensis), CP51 (B. kawakamii), CP68 (B. kawakamii)

DNA 跑膠 (使用2 ug DNA):CP91 很明顯 (濃度不知為何爆高的一支),其餘的都很淡,或幾乎沒有。

RAD-seq (下午三點,到農藝系陳凱儀老師實驗室,由學姊講解。搭配《RAD library 建構 protocol》文章一起食用。) 今天主要做 §1.2,DNA定量部分。4 Sample: CP92 (r1, B. ravenii), CP91 (a5, B. aristatoserrulata, not sure), CP51 (B. kawakamii), CP68 (B. kawakamii)。使用 Quant-iT 測濃度 (主要特色為,此機器會附上一瓶Reagent螢光劑,他只和抓在雙股上,單股如RNA便會側不到,可精確測到DNA而已。缺點為,此機器容易因問度而有誤差,每個測量樣本間都要隔15秒。) CP91 (a5, B. aristatoserrulata, not sure):分光光度計: 336.5 ug/mL, 1.95 260/280, 2.29260/230;Quant-iT:80.1 ug/mL, NanoDrop:625.8 ug/mLCP92 (r1, B. ravenii):分光光度計:133.5 ug/mL,2.03 260/280, 1.98 260/230;Quant-iT:49.5 ug/mL, NanoDrop:258.7 ug/mLCP51 (B. kawakamii):分光光度計:206.3 ug/mL, 1.27 260/280, 0.69 260/230;Quant-iT:30.4 ug/mL, NanoDrop:296.8 ug/mLCP68 (B. kawakamii):分光光度計:21.9 ug/mL, 1.45 260/280,0.41 260/230;Quant-iT:2.14 ug/mL, NanoDrop:2.7 ug/mL

Big problems !!! 1. 所有和自己在實驗室用分光光度計的濃度完全不同,也不夠實驗所需!而且有將近三到四倍的差異!2.雜質偏高 (蛋白質和鹽類!)

Next:試圖解決Bp1.:可能要先去和曲老師研究室借用他們測濃度 (否則差太多)。濃度不夠部分,要開始測試是否要增加放進去的sample (希望能將其數值量化,測出需要用多少克的葉子sample。) 寧願濃度太高再稀釋。若依然,其中的DNA量不夠,那可能同樣的sample就要多做幾管再混合。結果發現,使用Brendan的微調protocal,會比較好,其主要差別 (和Kit標準步驟) 僅在於在第一步要將樣本吸起吐入shearing tube中前,會先去離心,讓髒東西沉積,再抽取;以及最後TE buffer 的量,僅加入45 ug (Brendan僅為了方便在之後的PCR程序而已)。Bp2.:要加RNAase,分解掉RNA,以免誤導濃度偏高假象。鹽類汙染部分,可能和kit中的PX1或2有關,要算準比例,以免太多而殘留造成汙染。

To Champ:有點失望的結果,才剛起頭,希望能一次一次解決問題,別灰心!

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