【Experimental Log and Tips】2016/4/14

震碎 (參照【Experimental Log and Tips】2016/4/13)

DNA濃縮與片段篩選 (在自己實驗室)

濃縮:使用Monarch™ PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (NEB),分四管濃縮至80 μL。

片段篩選:兩次篩選 (先吸走>500 bp,再除去<200),洗兩次70%酒精!要記得呀!!!!

Qbit定量:濃縮完,體積75 μL,濃度40 ng/μL;">500 bp"體積20 μL,濃度為66.4 ng/μL;"200~500 bp"體積23 μL,濃度為40.6 ng/μL。]

↓↓↓↓↓↓↓↓↓   接下來都依照陳凱儀老師的protocol    ↓↓↓↓↓↓↓↓↓

DNA破裂端補反應 (30 min)

定量1 μg,開始修補反應。

P2 adapter連結反應 (接A:15 min;接P2:3 hr,中間皆須純化*3:30 min*3。)

三步純化。(每一次都要酒精洗兩次,要極度清醒注意:要留磁珠?還是要留溶液?萬萬不可搞混。)

得到RAD library template。

Qbit定量:RAD library template,體積20 μL,濃度8.8 (8.76) ng/μL。

RAD tag 擴增 (回到我的研究室做。)

起始量為50 ng。

使用NEBNext® Ultra™ II Q5® Master Mix。

使用陳凱儀老師PCR的program。

最後膠圖

20160414v1跑膠

最後純化後,濃度也依然足夠 (41.6 ng/uL),應有達可以上機的標準 (標準至少為10 ng/uL)

非常感謝陳凱儀老師實驗室的協助呀!!!!!!!!!

【Experimental Log and Tips】2016/4/13

DNA濃縮與片段篩選 (在自己實驗室) (參照【Experimental Log and Tips】2016/4/12)

接下去使用 NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®

1.1 NEBNext End Prep

最多需要使用1 µg的破碎片段的DNA。(上一部純化完,"200~500 bp"體積23 μL,濃度為46.8(47.6) ng/μL,故使用21 μL。)

1.2 Adaptor Ligation

使用陳凱儀老師的P2 adaptor (濃度為10 µM) 。上次依造kit的protocol (使用濃度為15 µM) 下2.5 μL,這次就調整,只下1µM,不足體積補水。怕下太多,P2 adaptor會亂黏。

1.3 Size Selection or Cleanup of Adaptor-ligated DNA

磁珠比較熟練了。

使用陳凱儀老師的PrimerMix。解除上次使用自己的擔憂。

完成RAD library template (體積誤溶為20 μL,濃度為6.76 ng/μL。裏頭有135.2 ng。)

1.4 PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA

在陳凱儀老師RAD tag擴增 protocol中,擴增起始量為50 ng。上次使用是不管template DNA片段濃度為多少,全放。這次就節省一些,也就只放50 ng (所以其中RAD library template的量足夠做兩次50 ng*2,所以此步後就分別做兩個擴增。)

1. 使用NEBNext Ultra II Q5 Master Mix,使用它的protocol的PCR program。(在自己家做) (膠圖 A)

2. 使用陳凱儀老師家的Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix,使用它陳凱儀老師家的protocol的PCR program。(在陳凱儀老師家做) (膠圖 B)

膠圖如下:

for_mail

1.5 Size Selection or Cleanup of Amplification

使用AMPure (0.7倍),各洗下20 μL。Final A:14.2 ng/μL;Final B:14.7 ng/μL。(滿足濃度要至少1o ng/μL的標準。)

討論

上次兩個方向討論問題 (參照【Experimental Log and Tips】2016/4/7):操作和藥品。能明顯感受到,上次最大癥結點:磁珠,使用有越來越熟練的趨勢。藥品,上次的過增的primer,這次都使用陳凱儀老師家的。所以感覺上有解決。

另外,比較大的改變是調整了P2 adapter的量 (降為陳凱儀老師protocol所設定的量),我在想,kit中的量趕下這麼多,是因為他們的adapter有專利loop,但因為我們是自己普通的,就下一般量就好了。以及擴增所下DNA量,原本全下,但這次定量下 (50 ng),不僅節省,且兩次都有做出來。

擴增後的片段變大,屬正常現象,吧。有可能為在擴增前的RAD library template,其小片段沒有擴增,之類的原因。但,至少有擴增就好了!

 

20160414 震碎

20160414v2

紅色箭頭,重新震碎。(注意,震碎七分鐘要數好!不要分心!)

20160414v3.jpg

右半部的"RAD template"和"擴增後 (未純化)"為Final (原 膠圖 A)

接下來的純化和片段篩選,為20160414開始進行。

【Experimental Log and Tips】2016/4/12

RAD-seq Library 製備 (依造陳凱儀老師研究室的protocol)

48 Samples (參照【Experimental Log and Tips】2016/03/31-4/1)

2016/03/31 Pst1-HF限制酶切割 (在自己實驗室) (參照【Experimental Log and Tips】2016/03/31-4/1)

2016/04/01  Pst1-HF限制酶去活性反應 (過去陳凱儀老師實驗室) + P1 Adapter 連結酶反應 (參照【Experimental Log and Tips】2016/03/31-4/1)

2016/4/12 樣品合併和震碎

樣品合併:因為超音波震碎機每次處理12個樣品,一個樣品為50 μL,總共600 μL。故600/48=12.5,每個樣品取12.5 μL合併於一管後,在各取50 μL分裝到12管。其餘未使用 (個體皆各自只到接完P1 adapter那步) 保存-20度。

震碎:7分鐘一循環,三循環 (21分鐘) 為一次基本震碎時間。加冰加冰水,注意!

跑膠:確認片段長度是否符合接下來所需求的 (200-500 bp左右)。

接下來和他們分裝了P2和Primer Mix回來自己研究室繼續實驗。

DNA濃縮與片段篩選 (在自己實驗室)

濃縮:使用Monarch™ PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (NEB),分四管濃縮至80 μL。(各19 μL*4溶出,最後合併76 μL,下一步磁珠需要75 μL) 使用Kit中的Binding Buffer:Sample= 5:1 (此condition是for收集小片段)。

片段篩選:兩次篩選:先吸走>500 bp,再除去<200,兩次,最後洗兩次70%酒精,用elution buffer溶出23 μL。第一次磁珠抓走500 bp,那次磁珠放很多,在回收溶液到下一步時,務必小心,不要讓磁珠脫落。去除<200 bp的這步,或許液體不容易完全吸乾,又或者容易把磁珠沖掉,可是磁珠上就是我們需要的,所以不能有損失。反正下一步就是洗酒精,磁珠在酒精中移動較沒有阻力,不小心脫落的就會被磁盤再吸住,不要那邊硬吸剩餘的液體,一旦磁珠進入tip之後,就會很麻煩。

20160411跑膠v1

Qbit定量時,"200~500 bp"體積23 μL,濃度為46.8(47.6) ng/μL;">500 bp"體積23 μL,濃度為55.4 (55.6) ng/μL。

討論:接下來的步驟,有兩個不同方法。一為陳凱儀老師的protocol;一為NEB的kit。也有和他們拿P2 adaptor和primer mix回來。希望能再震碎一批,分別嘗試這兩種方法。

【Experimental Log and Tips】2016/4/7

接續上一篇:https://champ1115.wordpress.com/2016/04/04/%E3%80%90experimental-log-and-tips%E3%80%9120160331-41/

接下來就是Blunting、接上P2,最後PCR擴增。使用Kit。NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®

開始所需:500 pg–1 µg的破碎片段的DNA。我使用1 µg的DNA。

1.1 NEBNext End Prep [以下非常重要的,均勻混合不能有泡泡。]

1.2 Adaptor Ligation [P2 adaptor使用陳凱儀老師的,10µM,kit protocol使用15µM。]

1.3 Size Selection or Cleanup of Adaptor-ligated DNA [要習慣控制磁珠和磁盤,這步會產生RAD library template。]

1.4 PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA [Primer是使用我們自己合成的]

1.5 Size Selection or Cleanup of Amplification [一樣使用磁珠。]

最後結果:不符合上機標準。濃度不足、片段偏大。

20160407跑膠

大於500 bp濃度:31.4 ng/μL;RAD library template濃度:7.34 ng/μL;RAD tag擴增後+磁珠篩選:8.74 ng/μL。

討論:我想有幾個主要變因。從操作和藥品兩大方向討論:

操作層面:

  1. 使用Monarch™ PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (NEB) 磁珠和磁盤,在200 μL PCR管中的控制,對我來說很是全新的,才正在習慣。我想可能這做得不夠熟練或精確,或還無法掌控磁盤,都有可能會導致回收率大受影響。正在越來越上手。
  2. 第一次使用PCR機器,也正在越來越熟悉中。由於PCR的溫度調節program都是依造kit上的protocol,應當沒有太大問題。(有問題應該似乎也很難調整…)
  3. 因為要PCR加的kit裏頭的master mix都很濃稠,再樣品混合的時候,要非常小心小力的pipette,而且不能吐到完產生氣泡,一旦產生氣泡,就會很麻煩,氣泡也不易消失。
  4. DNA片段大小問題。經過20160401震碎之後,片段介於200-500 bp左右。但在後面的幾步發現,"DNA濃縮與片段篩選 “、使用磁珠抓大於500 bp之後的"RAD library template",似乎片段都還是偏大一點。另外,再比較磁珠抓到的大於500 bp (特別留下洗下來的) 和RAD library template,在膠圖上看到的濃度掉了非常多 (體積皆溶20 μL),但片段的range卻有很大程度的overlap。不知道是否為磁珠還沒有控制得很好?還是有其他原因。(可能要查閱上次和竹因學姊一起做的膠圖做比較),在猜想是否是因為片段的大小差距不夠大?還是有其他原因?
  5. 再來討論RAD library template擴增前後。所溶的體積皆為20 μL。RAD library template會取出15 μL (內含110.1 ng DNA片段) 進行下一擴增,擴增起始量僅需50 ng。最後擴增完,再經磁珠純化後,回溶20 μL,濃度為8.74 ng/μL (內含174.8 ng DNA片段)。感覺過增完後再抓的片段和一開始放下去的差沒多少,似乎沒什麼"擴增感"。我會再用20160408再做一次的樣本 (RAD library template擴增後的原液) 作比較,我有跑膠,但其亮度其實和RAD library template差不多,所以才懷疑,擴增到底有沒有效果,這需要再做確定比較。

20160408跑膠

20160410補充:RAD library template :5.16 (5.04) ng/μL;RAD library template擴增後:18.8 (15.9) ng/μL;RAD library template擴增後,再磁珠篩選後:13.4 ng/μL。可以發現:

  1. PCR擴增,應當有效果。濃度大概成長三倍。但三倍是對的嗎?
  2. 我在磁珠篩選的前後,沒有掉太多濃度。
  3. 雖然此次的濃度雖然符合上機標準,但片段依然偏大。

我想要討論的問題 – 片段太大的問題。是和震碎大小有關嗎?(膠圖品質差,但隱約可看出篩選後的片段依然偏大。)

藥品層面:

  1. 70%的酒精,要先預備好!(磁珠純化時需要使用。) dd水有已滅菌且分裝好冰-20度冰箱。
  2. 我生性多疑,那兩支Primer到底有沒有東西在裏頭,一直想怪罪擴增前後沒啥改變給他們這樣。似乎要測測看濃度。(是說Qubit測得到嗎?)
  3. Qubit的kit調配也要更小心精準一些。

 

What about next?

  1. 關於片段過大,陳老師的信件回復中有提到:『李易整在製作其他物種的 RADseq library 也遇到和你相同的困境。我想 P1 adaptor 與 P2 adaptor 與 DNA 的莫耳數比的精確計算,會是改進的方向。接 P1時會需要估算 genomic DNA 經過 restriction enzyme 切割後,由DNA總量所推算的期望端點數目,來作P1加入量的計算。接P2時,則是直接由回收的 DNA 量來推算 P2 應該加入的量。』有個疑問:為何adaptor比例和長度為何有關連?
  2. 下禮拜一 (20160411) 下午一點半,會在過去找李易整學長。主要想請教一些他的 thumb rule。
  3. 想和陳凱儀老師借一些藥品:P2 adaptor、Solax primer mix兩端。想和我自己用Solax primer mix和kit做的結果做比較。(以解擴增primer有無差別)
  4. 在震碎一批,想一方面做原本protocol (想在農藝系那邊做),一方面做kit的 (借藥回來自己做),兩邊都同步進行。

【Experimental Log and Tips】2016/03/31-4/1

RAD-seq Library 製備 (依造陳凱儀老師研究室的protocol)

48 Samples:

編號 編號 物種 Barcode
1 CP227 B. alpicola ACACG
2 CP88 B. aristatoserrulata ACCAT
3 CPL015 B. aristatoserrulata ACGTA
4 CPL016 B. aristatoserrulata ACTGC
5 CP104 B. breviesepala AGAGT
6 CP170 B. breviesepala AGCTG
7 CP0191 B. breviesepala AGGAC
8 CPL006 B. breviesepala AGTCA
9 CPL018 B. breviesepala ATATC
10 CP139 B. chingshuiensis ATCGA
11 CP142 B. chingshuiensis ATGCT
12 CP141 B. chingshuiensis ATTAG
13 CP99 B. hayatana CAACT
14 CP173 B. hayatana CACAG
15 CP0221 B. hayatana CAGTC
16 CP124 B. kawakamii CATGA
17 CP0211 B. kawakamii CCGGT
18 CP0214 B. kawakamii CCTTG
19 CP0237-1 B. kawakamii CGATA
20 CP0224 B. kawakamii CGCGC
21 CP0172 B. kawakamii CGTAT
22 CP123 B. nantoensis CTAGG
23 CP0184 B. nantoensis CTCTT
24 CPL002 B. nantoensis CTGAA
25 CPL003 B. nantoensis CTTCC
26 CP0231-1 B. pengii GAAGC
27 CP0232-1 B. pengii GACTA
28 CP0233-1 B. pengii GAGAT
29 CP0238-1 B. pengii GATCG
30 CPL013 B. pengii GCATT
31 CPL014 B. pengii GCGCC
32 CP92 B. ravenii GCTAA
33 CPL10 B. ravenii GGTTC
34 CPL11 B. ravenii GTACA
35 CP115 B. schaaliae GTCAC
36 CP132 B. schaaliae GTGTG
37 CP0197 B. schaaliae GTTGT
38 CPL007 B. tarokoensis TAATG
39 CPL008 B. tarokoensis TACGT
40 CPL009 B. tarokoensis TAGCA
41 CPL004 B. mingetsensis TATAC
42 CPL005 B. mingetsensis TCAGA
43 CP146 B. mingtsuensis TCGAG
44 B318a B. baradana TCTCT
45 B318b B. baradana TGACC
46 武1 B. wuyiensis TGCAA
47 武3 B. wuyiensis TGTGG
48 M1 B. morii TTAAT

2016/03/31 Pst1-HF限制酶切割 (在自己實驗室)

準備好sample們,確定定過量,片段大小盡量完整,過cleanup kit。

Monarch™ PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (NEB) 其上限抓5 μg的DNA。實際測試過發現:我的sample測到最高濃度約為120 ng/μL左右。120 ng/μL*50 uL=6000 ng=6 μg。發現和kit所標示差不多。甚至又多上一點。5 μg應為保證量。

注意!要先算好稀釋比例:加多少水和多少DNA溶液。

算好37度培養箱過夜 (15小時) 時間,從3/31下午6:40開始,隔天4/1早上9:55收,也要緊接下一步PCR去活性。

2016/04/01 

Pst1-HF限制酶去活性反應 (過去陳凱儀老師實驗室)

PCR機器溫度設定:80度後就讓它自然降溫1小時,不要強制低溫。否則會亂黏。(給新助理和自己的提醒)

P1 Adapter 連結酶反應

P1 Adapter上有barcode,必須先挑好barcode,以及準備好一張對照紀錄單子,在加的時候要做三次確認。此部很重要,意味著一個sample就綁住一組barcode,在最後資料分析時就代表此個體。(也是NGS的一大優勢呀)

此步要配一支master mix。我這裡雖然是48個sample,保險起見,我配50個體的量,但依然還是不夠。我想是我自己的實驗操作問題和pipette error,在吸取的時候可能讓液體黏太多tip管壁上 (尤其CutSmart Buffer很黏稠),導致嚴重誤差。我想要非常注意才行。

rATP要分裝,重複解凍結凍容易失能。

PCR機器:20度一小時 (接P1)、65度20分鐘 (去活性),然後在機器裡自然降溫。

樣品合併和震碎

樣品合併:因為超音波震碎機每次處理12個樣品,一個樣品為50 μL,總共600 μL。故600/48=12.5,每個樣品取12.5 μL合併於一管後,在各取50 μL分裝到12管。其餘未使用 (個體皆各自只到接完P1 adapter那步) 保存-20度。

震碎:7分鐘一循環,三循環 (21分鐘) 為一次基本震碎時間。加冰加冰水,注意!

跑膠:確認片段長度是否符合接下來所需求的 (200-500 bp左右)。幸好我一次OK。

接下來和他們分裝了P2回來自己研究室繼續實驗。

DNA濃縮與片段篩選 (在自己實驗室)

濃縮:使用Monarch™ PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (NEB),分兩管濃縮至80 μL。(各40 μL*2) 使用Binding Buffer:Sample= 5:1 (此condition是for收集小片段)。(其實,我覺得這步就可以先跑膠看長度耶。因為如果片段就集中在300~500 bp左右,在之後加大片段就容易抓到到500 bo左右的,會導致最後剩下的濃度可能會不足。)

片段篩選:磁珠在磁珠溶液或DNA溶液中,似乎阻力有點大,在磁鐵吸引上的移動似乎有點緩慢。但在酒精沖洗時,吸引的移動速度就很快。然後要有耐性。

20160401跑膠

Qbit定量時,右圖的"200~500 bp"體積23uL,濃度為35.8 ng/uL (不夠下一階段的濃度50 ng/uL) 左圖為片段篩選完後的跑膠,"200~500 bp"和"大於500 bp"的看起來片段大小很接近 (似乎是重疊了?) 所以我就將"200~500 bp"和"大於500 bp"兩管混合,體積44uL,濃度為64.2 ng/uL。右圖,將"200~500 bp"和"大於500 bp"混合後,再跑了一次,看起來大於500 bp片段還有一點。我希望這些為大於的不要影響太多200-500 bp的濃度 (接下來要的),常片段希望在接p2的純化後可以除去。

(目前如此,等待NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®到來,就等最後一步的DNA破裂修補和P2 adapter連結和最後的RAD tag擴增。)