【Experimental Log and Tips】2016/03/31-4/1

RAD-seq Library 製備 (依造陳凱儀老師研究室的protocol)

48 Samples:

編號 編號 物種 Barcode
1 CP227 B. alpicola ACACG
2 CP88 B. aristatoserrulata ACCAT
3 CPL015 B. aristatoserrulata ACGTA
4 CPL016 B. aristatoserrulata ACTGC
5 CP104 B. breviesepala AGAGT
6 CP170 B. breviesepala AGCTG
7 CP0191 B. breviesepala AGGAC
8 CPL006 B. breviesepala AGTCA
9 CPL018 B. breviesepala ATATC
10 CP139 B. chingshuiensis ATCGA
11 CP142 B. chingshuiensis ATGCT
12 CP141 B. chingshuiensis ATTAG
13 CP99 B. hayatana CAACT
14 CP173 B. hayatana CACAG
15 CP0221 B. hayatana CAGTC
16 CP124 B. kawakamii CATGA
17 CP0211 B. kawakamii CCGGT
18 CP0214 B. kawakamii CCTTG
19 CP0237-1 B. kawakamii CGATA
20 CP0224 B. kawakamii CGCGC
21 CP0172 B. kawakamii CGTAT
22 CP123 B. nantoensis CTAGG
23 CP0184 B. nantoensis CTCTT
24 CPL002 B. nantoensis CTGAA
25 CPL003 B. nantoensis CTTCC
26 CP0231-1 B. pengii GAAGC
27 CP0232-1 B. pengii GACTA
28 CP0233-1 B. pengii GAGAT
29 CP0238-1 B. pengii GATCG
30 CPL013 B. pengii GCATT
31 CPL014 B. pengii GCGCC
32 CP92 B. ravenii GCTAA
33 CPL10 B. ravenii GGTTC
34 CPL11 B. ravenii GTACA
35 CP115 B. schaaliae GTCAC
36 CP132 B. schaaliae GTGTG
37 CP0197 B. schaaliae GTTGT
38 CPL007 B. tarokoensis TAATG
39 CPL008 B. tarokoensis TACGT
40 CPL009 B. tarokoensis TAGCA
41 CPL004 B. mingetsensis TATAC
42 CPL005 B. mingetsensis TCAGA
43 CP146 B. mingtsuensis TCGAG
44 B318a B. baradana TCTCT
45 B318b B. baradana TGACC
46 武1 B. wuyiensis TGCAA
47 武3 B. wuyiensis TGTGG
48 M1 B. morii TTAAT

2016/03/31 Pst1-HF限制酶切割 (在自己實驗室)

準備好sample們,確定定過量,片段大小盡量完整,過cleanup kit。

Monarch™ PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (NEB) 其上限抓5 μg的DNA。實際測試過發現:我的sample測到最高濃度約為120 ng/μL左右。120 ng/μL*50 uL=6000 ng=6 μg。發現和kit所標示差不多。甚至又多上一點。5 μg應為保證量。

注意!要先算好稀釋比例:加多少水和多少DNA溶液。

算好37度培養箱過夜 (15小時) 時間,從3/31下午6:40開始,隔天4/1早上9:55收,也要緊接下一步PCR去活性。

2016/04/01 

Pst1-HF限制酶去活性反應 (過去陳凱儀老師實驗室)

PCR機器溫度設定:80度後就讓它自然降溫1小時,不要強制低溫。否則會亂黏。(給新助理和自己的提醒)

P1 Adapter 連結酶反應

P1 Adapter上有barcode,必須先挑好barcode,以及準備好一張對照紀錄單子,在加的時候要做三次確認。此部很重要,意味著一個sample就綁住一組barcode,在最後資料分析時就代表此個體。(也是NGS的一大優勢呀)

此步要配一支master mix。我這裡雖然是48個sample,保險起見,我配50個體的量,但依然還是不夠。我想是我自己的實驗操作問題和pipette error,在吸取的時候可能讓液體黏太多tip管壁上 (尤其CutSmart Buffer很黏稠),導致嚴重誤差。我想要非常注意才行。

rATP要分裝,重複解凍結凍容易失能。

PCR機器:20度一小時 (接P1)、65度20分鐘 (去活性),然後在機器裡自然降溫。

樣品合併和震碎

樣品合併:因為超音波震碎機每次處理12個樣品,一個樣品為50 μL,總共600 μL。故600/48=12.5,每個樣品取12.5 μL合併於一管後,在各取50 μL分裝到12管。其餘未使用 (個體皆各自只到接完P1 adapter那步) 保存-20度。

震碎:7分鐘一循環,三循環 (21分鐘) 為一次基本震碎時間。加冰加冰水,注意!

跑膠:確認片段長度是否符合接下來所需求的 (200-500 bp左右)。幸好我一次OK。

接下來和他們分裝了P2回來自己研究室繼續實驗。

DNA濃縮與片段篩選 (在自己實驗室)

濃縮:使用Monarch™ PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (NEB),分兩管濃縮至80 μL。(各40 μL*2) 使用Binding Buffer:Sample= 5:1 (此condition是for收集小片段)。(其實,我覺得這步就可以先跑膠看長度耶。因為如果片段就集中在300~500 bp左右,在之後加大片段就容易抓到到500 bo左右的,會導致最後剩下的濃度可能會不足。)

片段篩選:磁珠在磁珠溶液或DNA溶液中,似乎阻力有點大,在磁鐵吸引上的移動似乎有點緩慢。但在酒精沖洗時,吸引的移動速度就很快。然後要有耐性。

20160401跑膠

Qbit定量時,右圖的"200~500 bp"體積23uL,濃度為35.8 ng/uL (不夠下一階段的濃度50 ng/uL) 左圖為片段篩選完後的跑膠,"200~500 bp"和"大於500 bp"的看起來片段大小很接近 (似乎是重疊了?) 所以我就將"200~500 bp"和"大於500 bp"兩管混合,體積44uL,濃度為64.2 ng/uL。右圖,將"200~500 bp"和"大於500 bp"混合後,再跑了一次,看起來大於500 bp片段還有一點。我希望這些為大於的不要影響太多200-500 bp的濃度 (接下來要的),常片段希望在接p2的純化後可以除去。

(目前如此,等待NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®到來,就等最後一步的DNA破裂修補和P2 adapter連結和最後的RAD tag擴增。)

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