【Experimental Log and Tips】2016/4/7

接續上一篇:https://champ1115.wordpress.com/2016/04/04/%E3%80%90experimental-log-and-tips%E3%80%9120160331-41/

接下來就是Blunting、接上P2,最後PCR擴增。使用Kit。NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®

開始所需:500 pg–1 µg的破碎片段的DNA。我使用1 µg的DNA。

1.1 NEBNext End Prep [以下非常重要的,均勻混合不能有泡泡。]

1.2 Adaptor Ligation [P2 adaptor使用陳凱儀老師的,10µM,kit protocol使用15µM。]

1.3 Size Selection or Cleanup of Adaptor-ligated DNA [要習慣控制磁珠和磁盤,這步會產生RAD library template。]

1.4 PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA [Primer是使用我們自己合成的]

1.5 Size Selection or Cleanup of Amplification [一樣使用磁珠。]

最後結果:不符合上機標準。濃度不足、片段偏大。

20160407跑膠

大於500 bp濃度:31.4 ng/μL;RAD library template濃度:7.34 ng/μL;RAD tag擴增後+磁珠篩選:8.74 ng/μL。

討論:我想有幾個主要變因。從操作和藥品兩大方向討論:

操作層面:

  1. 使用Monarch™ PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (NEB) 磁珠和磁盤,在200 μL PCR管中的控制,對我來說很是全新的,才正在習慣。我想可能這做得不夠熟練或精確,或還無法掌控磁盤,都有可能會導致回收率大受影響。正在越來越上手。
  2. 第一次使用PCR機器,也正在越來越熟悉中。由於PCR的溫度調節program都是依造kit上的protocol,應當沒有太大問題。(有問題應該似乎也很難調整…)
  3. 因為要PCR加的kit裏頭的master mix都很濃稠,再樣品混合的時候,要非常小心小力的pipette,而且不能吐到完產生氣泡,一旦產生氣泡,就會很麻煩,氣泡也不易消失。
  4. DNA片段大小問題。經過20160401震碎之後,片段介於200-500 bp左右。但在後面的幾步發現,"DNA濃縮與片段篩選 “、使用磁珠抓大於500 bp之後的"RAD library template",似乎片段都還是偏大一點。另外,再比較磁珠抓到的大於500 bp (特別留下洗下來的) 和RAD library template,在膠圖上看到的濃度掉了非常多 (體積皆溶20 μL),但片段的range卻有很大程度的overlap。不知道是否為磁珠還沒有控制得很好?還是有其他原因。(可能要查閱上次和竹因學姊一起做的膠圖做比較),在猜想是否是因為片段的大小差距不夠大?還是有其他原因?
  5. 再來討論RAD library template擴增前後。所溶的體積皆為20 μL。RAD library template會取出15 μL (內含110.1 ng DNA片段) 進行下一擴增,擴增起始量僅需50 ng。最後擴增完,再經磁珠純化後,回溶20 μL,濃度為8.74 ng/μL (內含174.8 ng DNA片段)。感覺過增完後再抓的片段和一開始放下去的差沒多少,似乎沒什麼"擴增感"。我會再用20160408再做一次的樣本 (RAD library template擴增後的原液) 作比較,我有跑膠,但其亮度其實和RAD library template差不多,所以才懷疑,擴增到底有沒有效果,這需要再做確定比較。

20160408跑膠

20160410補充:RAD library template :5.16 (5.04) ng/μL;RAD library template擴增後:18.8 (15.9) ng/μL;RAD library template擴增後,再磁珠篩選後:13.4 ng/μL。可以發現:

  1. PCR擴增,應當有效果。濃度大概成長三倍。但三倍是對的嗎?
  2. 我在磁珠篩選的前後,沒有掉太多濃度。
  3. 雖然此次的濃度雖然符合上機標準,但片段依然偏大。

我想要討論的問題 – 片段太大的問題。是和震碎大小有關嗎?(膠圖品質差,但隱約可看出篩選後的片段依然偏大。)

藥品層面:

  1. 70%的酒精,要先預備好!(磁珠純化時需要使用。) dd水有已滅菌且分裝好冰-20度冰箱。
  2. 我生性多疑,那兩支Primer到底有沒有東西在裏頭,一直想怪罪擴增前後沒啥改變給他們這樣。似乎要測測看濃度。(是說Qubit測得到嗎?)
  3. Qubit的kit調配也要更小心精準一些。

 

What about next?

  1. 關於片段過大,陳老師的信件回復中有提到:『李易整在製作其他物種的 RADseq library 也遇到和你相同的困境。我想 P1 adaptor 與 P2 adaptor 與 DNA 的莫耳數比的精確計算,會是改進的方向。接 P1時會需要估算 genomic DNA 經過 restriction enzyme 切割後,由DNA總量所推算的期望端點數目,來作P1加入量的計算。接P2時,則是直接由回收的 DNA 量來推算 P2 應該加入的量。』有個疑問:為何adaptor比例和長度為何有關連?
  2. 下禮拜一 (20160411) 下午一點半,會在過去找李易整學長。主要想請教一些他的 thumb rule。
  3. 想和陳凱儀老師借一些藥品:P2 adaptor、Solax primer mix兩端。想和我自己用Solax primer mix和kit做的結果做比較。(以解擴增primer有無差別)
  4. 在震碎一批,想一方面做原本protocol (想在農藝系那邊做),一方面做kit的 (借藥回來自己做),兩邊都同步進行。
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對「【Experimental Log and Tips】2016/4/7」的想法

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