【Experimental Log and Tips】2016/4/12

RAD-seq Library 製備 (依造陳凱儀老師研究室的protocol)

48 Samples (參照【Experimental Log and Tips】2016/03/31-4/1)

2016/03/31 Pst1-HF限制酶切割 (在自己實驗室) (參照【Experimental Log and Tips】2016/03/31-4/1)

2016/04/01  Pst1-HF限制酶去活性反應 (過去陳凱儀老師實驗室) + P1 Adapter 連結酶反應 (參照【Experimental Log and Tips】2016/03/31-4/1)

2016/4/12 樣品合併和震碎

樣品合併:因為超音波震碎機每次處理12個樣品,一個樣品為50 μL,總共600 μL。故600/48=12.5,每個樣品取12.5 μL合併於一管後,在各取50 μL分裝到12管。其餘未使用 (個體皆各自只到接完P1 adapter那步) 保存-20度。

震碎:7分鐘一循環,三循環 (21分鐘) 為一次基本震碎時間。加冰加冰水,注意!

跑膠:確認片段長度是否符合接下來所需求的 (200-500 bp左右)。

接下來和他們分裝了P2和Primer Mix回來自己研究室繼續實驗。

DNA濃縮與片段篩選 (在自己實驗室)

濃縮:使用Monarch™ PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (NEB),分四管濃縮至80 μL。(各19 μL*4溶出,最後合併76 μL,下一步磁珠需要75 μL) 使用Kit中的Binding Buffer:Sample= 5:1 (此condition是for收集小片段)。

片段篩選:兩次篩選:先吸走>500 bp,再除去<200,兩次,最後洗兩次70%酒精,用elution buffer溶出23 μL。第一次磁珠抓走500 bp,那次磁珠放很多,在回收溶液到下一步時,務必小心,不要讓磁珠脫落。去除<200 bp的這步,或許液體不容易完全吸乾,又或者容易把磁珠沖掉,可是磁珠上就是我們需要的,所以不能有損失。反正下一步就是洗酒精,磁珠在酒精中移動較沒有阻力,不小心脫落的就會被磁盤再吸住,不要那邊硬吸剩餘的液體,一旦磁珠進入tip之後,就會很麻煩。

20160411跑膠v1

Qbit定量時,"200~500 bp"體積23 μL,濃度為46.8(47.6) ng/μL;">500 bp"體積23 μL,濃度為55.4 (55.6) ng/μL。

討論:接下來的步驟,有兩個不同方法。一為陳凱儀老師的protocol;一為NEB的kit。也有和他們拿P2 adaptor和primer mix回來。希望能再震碎一批,分別嘗試這兩種方法。

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