【Experimental Log and Tips】2016/4/13

DNA濃縮與片段篩選 (在自己實驗室) (參照【Experimental Log and Tips】2016/4/12)

接下去使用 NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina®

1.1 NEBNext End Prep

最多需要使用1 µg的破碎片段的DNA。(上一部純化完,"200~500 bp"體積23 μL,濃度為46.8(47.6) ng/μL,故使用21 μL。)

1.2 Adaptor Ligation

使用陳凱儀老師的P2 adaptor (濃度為10 µM) 。上次依造kit的protocol (使用濃度為15 µM) 下2.5 μL,這次就調整,只下1µM,不足體積補水。怕下太多,P2 adaptor會亂黏。

1.3 Size Selection or Cleanup of Adaptor-ligated DNA

磁珠比較熟練了。

使用陳凱儀老師的PrimerMix。解除上次使用自己的擔憂。

完成RAD library template (體積誤溶為20 μL,濃度為6.76 ng/μL。裏頭有135.2 ng。)

1.4 PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA

在陳凱儀老師RAD tag擴增 protocol中,擴增起始量為50 ng。上次使用是不管template DNA片段濃度為多少,全放。這次就節省一些,也就只放50 ng (所以其中RAD library template的量足夠做兩次50 ng*2,所以此步後就分別做兩個擴增。)

1. 使用NEBNext Ultra II Q5 Master Mix,使用它的protocol的PCR program。(在自己家做) (膠圖 A)

2. 使用陳凱儀老師家的Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix,使用它陳凱儀老師家的protocol的PCR program。(在陳凱儀老師家做) (膠圖 B)

膠圖如下:

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1.5 Size Selection or Cleanup of Amplification

使用AMPure (0.7倍),各洗下20 μL。Final A:14.2 ng/μL;Final B:14.7 ng/μL。(滿足濃度要至少1o ng/μL的標準。)

討論

上次兩個方向討論問題 (參照【Experimental Log and Tips】2016/4/7):操作和藥品。能明顯感受到,上次最大癥結點:磁珠,使用有越來越熟練的趨勢。藥品,上次的過增的primer,這次都使用陳凱儀老師家的。所以感覺上有解決。

另外,比較大的改變是調整了P2 adapter的量 (降為陳凱儀老師protocol所設定的量),我在想,kit中的量趕下這麼多,是因為他們的adapter有專利loop,但因為我們是自己普通的,就下一般量就好了。以及擴增所下DNA量,原本全下,但這次定量下 (50 ng),不僅節省,且兩次都有做出來。

擴增後的片段變大,屬正常現象,吧。有可能為在擴增前的RAD library template,其小片段沒有擴增,之類的原因。但,至少有擴增就好了!

 

20160414 震碎

20160414v2

紅色箭頭,重新震碎。(注意,震碎七分鐘要數好!不要分心!)

20160414v3.jpg

右半部的"RAD template"和"擴增後 (未純化)"為Final (原 膠圖 A)

接下來的純化和片段篩選,為20160414開始進行。

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