【Experimental Log and Tips】2016/4/14

震碎 (參照【Experimental Log and Tips】2016/4/13)

DNA濃縮與片段篩選 (在自己實驗室)

濃縮:使用Monarch™ PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) (NEB),分四管濃縮至80 μL。

片段篩選:兩次篩選 (先吸走>500 bp,再除去<200),洗兩次70%酒精!要記得呀!!!!

Qbit定量:濃縮完,體積75 μL,濃度40 ng/μL;">500 bp"體積20 μL,濃度為66.4 ng/μL;"200~500 bp"體積23 μL,濃度為40.6 ng/μL。]

↓↓↓↓↓↓↓↓↓   接下來都依照陳凱儀老師的protocol    ↓↓↓↓↓↓↓↓↓

DNA破裂端補反應 (30 min)

定量1 μg,開始修補反應。

P2 adapter連結反應 (接A:15 min;接P2:3 hr,中間皆須純化*3:30 min*3。)

三步純化。(每一次都要酒精洗兩次,要極度清醒注意:要留磁珠?還是要留溶液?萬萬不可搞混。)

得到RAD library template。

Qbit定量:RAD library template,體積20 μL,濃度8.8 (8.76) ng/μL。

RAD tag 擴增 (回到我的研究室做。)

起始量為50 ng。

使用NEBNext® Ultra™ II Q5® Master Mix。

使用陳凱儀老師PCR的program。

最後膠圖

20160414v1跑膠

最後純化後,濃度也依然足夠 (41.6 ng/uL),應有達可以上機的標準 (標準至少為10 ng/uL)

非常感謝陳凱儀老師實驗室的協助呀!!!!!!!!!

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