[RAD seq classic] 關於RAD seq (2)。

上一篇用比較概念性地介紹了RAD seq,這一篇就說說RAD seq的壞話(error和bias)

這些偏誤的產生大致上可分成兩個原因,一類來自於本身次世代定序的問題:另一類就是本質上的問題(library的備製和後續的資料分析。)

1.  Allele dropout and null alleles. 等位基因遺漏和無效等位基因。導致這樣的原因,有幾個像是在樣本本身基因組的限制脢切位上發生多態性(polymorphism),這樣就會導致此片段無法被切到,而無法順利取樣到,就會此這段基因遺漏。或是SNP來自於無效對偶基因(null alleles)也會此後續分析發生問題。若是使用雙限制酶切割,會導致片段過長而在後續的片段篩選時被篩掉。所以也有一些模擬的研究認為,由於在切位上的突變所造成的Allele dropout影響,對於使用雙限制酶的RAD seq會比用原始RAD seq(單一限制酶)的影響來得嚴重。(另外亦會影響族群遺傳FST )

2. PCR duplicates and genotyping errors. 大部分的NGS Library的建置,original template DNA都會歷經一段PCR放大階段。由於隨機的PCR可能會導致原本是heterozygotes對偶基因在偏誤地放大下,在後續分析時誤解成homozygotes。在過去研究中發現PCR duplicates在RAD seq的data中發生機率高(20–60% of reads),雖然理論上PCR不會特定放大某些alleles,若真正發生在大量資料中的話,在分析上就會有問題。總之,RADseq建庫的過程中,一旦發生PCR duplicates,就會導致偏誤。然而這樣的問題可以在後續的資訊處理時解決,以增進genotyping的精確度。[看Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics 圖2,易懂。]

3. Variance in depth of coverage among loci. 由於PCR duplicates和allele dropout皆會導致genotyping errors,兩者都是在定序時,僅將特定(也就是最後留下來,preferential amplification,優先放大)序列定出,導致數量的偏誤。但這裡和前者不同的是,有時雖然都會被定序出來,但不同的reads在最後定序的數量(sufficient depth?)結果不一定會一致,在最後分析深度篩選時,便容易會漏掉某些深度較低的基因座。這樣的問題通常會發生在RADseq建庫時的PCR步驟,過去通常會說preferential amplification的發生和GC content有關;以及發生在較短的reads上(和長reads相比)。所以若以長度影響為影響因素的話,這樣的情形比較容易發生在由兩個限制酶切割的RADseq方法(reads長度不一致),至於2bRAD或原始RAD就不會有影響(因為他們的reads長度是一致的)。除了PCR步驟會影響以外,另一個影響會是在機械震碎步驟(mechanical shearing,在原始的RAD中的步驟),但是目前使用原始RADseq的研究中並未發現這有特別的影響,因為大部分使用rare cutters所裁減的片段,多>10 kb。但是但是,其實這在真正研究操作時,還是會遇到這樣的情況。在陳凱儀老師那就發生過了,主要還咬考慮到一個因素:DNA本身的quality,若品質很糟的話(像是片段太破碎),會非常在震碎那一步,會比新鮮材料的DNA來得容易震短。[分析深度參差原因→PCR步驟(GC content)&短的reads(mechanical shearing or low DNA quality)]

 

Andrews, K. R., Good, J. M., Miller, M. R., Luikart, G., & Hohenlohe, P. A. (2016). Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics. Nature Reviews. Genetics17(2), 81.

 

之後來聊聊設計RADseq研究的前提和準備吧。

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