20190501-0507 RAD-Seq Library備置測試

主要使用陳凱儀 老師lab的protocol

1.2 限制酶切割

使用Cut Smart Buffer，37°C培養，使用PCR機。

1.3 P1 Adapter連結酶反應

1.4 樣本合併

一次震碎體積為100uL，一次可震12個合併樣本。40個樣本，每個需取（1200/40）uL。

1.5 混合樣品DNA分子的隨機斷裂

第一次使用7cycles （15on/90off，為bioruptor的400bp建議設定）。但結果發現，大部分片段散開，片段大小不集中。皆不若上次。

接續為4cycles ，接續上補，並確認膠圖，直至片段多集中於400～500bp為主。

最多震碎cycles為7+4+4+4+4，最少為7+4+4。

此圖如B，便為可符合此步驟標準。

12管，由我和瓊之一人六管（為原來protocoal的總量），兩人分別繼續後續步驟。

1.6 DNA的濃縮與片段篩選

此步驟的DNA濃縮，使用Monarch® PCR & DNA Cleanup Kit (5 μg) 兩管回收，Wash buffer步驟僅使用兩次，使用水回溶，最後合併約70ul的溶液。

片段篩選後，最後回溶25uL左右，測濃度和跑膠各使用1uL，故剩餘23uL。

此步發現，>500bp的DNA片段過多（濃度大），故又另將>500bp的DNA片段震碎。並以標記「•」和原200~500bp在分管進行。

此步之後，我和瓊之各有兩管：一為原200~500bp（我：35ug/uL，瓊之：24.2ug/uL），另一為 • 200~500bp （我：18.1ug/uL，瓊之：12.2ug/uL）分管進行下面步驟。

1.7 DNA破裂端修補反應

由於總兩管總量（200~500bp、 • 200~500bp，體積為23uL）皆不足所需的1ug。故將其真空濃縮至19uL，以符合此步驟體積。

1.8 P2 adapter連結反應

此步驟共有5步：1.8 1、1.8 2、1.8 3、1.8 4、1.8 5，最後回溶22uL，測濃度和跑膠各使用1uL。（1.8 1、1.8 3、1.8 5，有留約1ul後續一起跑膠。）

片段篩選後的RAD library template濃度為：我：1.8 5：7.5ug/uL、 • 1.8 5：3.82ug/uL，瓊之：1.8 5：6.52ug/uL、 • 1.8 5：4.48ug/uL（protocol階段目標至少為：3ng/ul，最後體積為20ul，DNA量才能達50ng。）

1.9 RAD tag 擴增

1.9 1：RAD library template擴增。

我：1.8 5：7.5ug/uL，取7uL、 • 1.8 5：3.82ug/uL，取14uL，達50ng，開始擴增。

亦測試：我：1.9 1：0.436 ug/uL，瓊之：1.9 1：0.578 ug/uL。(此步體積為100ul，DNA總量為50ng。和當初放入的DNA總量一樣，並未擴增。)

1.9 2：RAD library template擴增+純化。

1.9 1 經0.7倍磁珠純化後的 1.9 2，幾乎已無DNA。